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科研進展

廣州生物院合作揭示小鼠早期胚胎發育過程中全胚層時空分子譜系

發表日期:2019-08-07來源:放大 縮小
  北京时间8月8日凌晨,国际权威学术期刊Nature在线发表了中國科學院分子细胞科学卓越创新中心/生物化学与细胞生物学研究所景乃禾课题组、中國科學院-马普学会计算生物学伙伴研究所韩敬东课题组与中國科學院广州生物医药与健康研究院彭广敦课题组共同合作的最新研究成果:“Molecular architecture of lineage allocation and tissue organization in early mouse embryo”。该研究首次构建了小鼠早期胚胎着床后发育时期高分辨率时空转录组图谱,揭示了小鼠胚胎多能干细胞的分子谱系和多能性在时间和空间上的动态变化及其调控网络,并首次从分子层面揭示了内胚层(Endoderm)谱系在上胚层(Epiblast)产生前新的谱系来源,阐释了Hippo/Yap信號通路在早期胚胎發育期間參與內胚層發育的重要功能。這項工作爲理解胚層譜系建立及多能幹細胞的命運調控機制,提供了翔實的數據和嶄新的思路,是對經典發育生物學層級譜系理論的重大修正和補充,將極大推動早期胚胎發育和幹細胞再生醫學相關領域的發展。

  生命作为自然最美的杰作,其诞生过程令人着迷。在早期胚胎发育阶段,受精卵通过细胞增殖和细胞分化形成囊胚;囊胚在子宫着床后经过原肠运动(Gastrulation)形成外、中、内三个胚层。外胚层将发育成机体的神经、皮肤等组织,中胚层将发育成心脏、血液、肌肉和骨骼等组织,而内胚层则发育成肺、肝、胰腺和肠等内脏器官。因此,外、中、内三胚层的形成过程对于胚胎发育的正常进行十分重要,并影响胎儿是否能够顺利从母体诞生。正如英国著名发育生物学家Lewis Wolpert所说:“人生最重要的阶段不是出生和结婚,甚至不是死亡,而是原肠运动。”原肠运动在进化上非常保守,其机制受到精细而严谨的调控,是最为引人入胜的发育生物学过程。

  通過經典的細胞標記移植和譜系追蹤等方法,發育生物學家在上世紀八九十年代已經初步建立了小鼠胚胎的細胞命運圖譜。這些研究發現,細胞的空間位置對于細胞命運具有重要的影響。例如,各胚層的前體細胞在原腸胚形成之前的上胚層中具有特定的空間區域,而當原腸運動完成後,前端外胚層細胞將按照頭尾(Cranio-caudal)的次序,發育爲大腦及脊髓等具有嚴謹前後次序的中樞神經系統。然而小鼠早期胚胎發育、特別是原腸運動時期的胚層譜系建立及細胞命運決定的分子機制尚不清晰,亟需從時間和空間尺度,在全基因組層面闡釋其調控關系。

  随着单细胞转录组测序技术的迅猛发展,传统上快速动态变化的胚胎发育过程,获得了类似于分子显微镜一样的利器。借助单细胞转录组测序,多篇针对原肠运动期间细胞命运决定的工作陆续在Nature杂志上发表,形成研究热点。例如John C. Marioni和Berthold Gottgens实验室合作,构建了小鼠原肠运动(E6.5)到器官发生早期阶段(E8.5)的细胞命运变化路径(Pijuan-Sala et al., 2019);同时发表的另一项工作(Cao et al., 2019)研究了小鼠器官发生阶段(E9.5-E13.5)的单细胞转录组情况,鉴定出56种胚胎细胞的发育轨迹;随后Anna-Katerina Hadjantonakis和Dana Pe’er实验室共同在单细胞转录组水平上解析了内胚层细胞的发育路径(Nowotschin et al., 2019);Chan等结合基因编辑技术进行谱系示踪,揭示了原肠运动期间的谱系转换,证实内胚层具有两重起源,分别来自胚外部分和胚胎部分(Chan et al., 2019)。

  虽然单细胞转录组分析可以重建胚胎细胞的发育轨迹,但缺乏真实的空间信息,无法将发育调控过程中的时间和空间信息联合分析,而细胞在早期胚胎中的空间位置对其发育分化命运又是至关重要的。为解决这一难题,景乃禾课题组及其合作团队多年来在这一领域深耕,建立了一种基于激光显微切割的低起始量空间转录组分析方法(Geo-seq)(Chen et al., 2017),并首先完成了原肠运动中期外胚层的三维空间分子图谱(Peng et al., 2016),进一步利用该技术对小鼠早期胚胎发育多个时期(E5.5、E6.0、E6.5、E7.0和E7.5)的外、中、内三个胚层构建空间转录组,建立起百科全书式全基因组的时空表达数据库(http://egastrulation.sibcb.ac.cn/)。此数据库实现了小鼠早期胚胎所有表达基因高分辨率的数字化原位杂交图谱,可供其他研究者查询和分析基因的三维表达模式、共表达关系以及根据特征表达模式检索基因等。这是目前国际上关于小鼠原肠运动时期最全面、最完整的交互性时空转录组数据库。

                                                                                          

    图1. Geo-seq样品收集示意图和二维数据可视化(corn-plot)

  Geo-seq收取E5.5-E7.5五個時期的上胚層/外胚層和內胚層,收取E7.0和E7.5時期的中胚層。根據胚胎大小和胚胎結構的複雜程度,分不同區域收取。對三維空間轉錄的基因表達進行平面化展示,構建corn-plot。紅色代表高表達,不同的點代表不同的樣品。

  为揭示不同时期、不同空间位置的胚胎细胞在胚层谱系上的联系,研究人员借鉴更具生物学意义、更加稳健的SCENIC数据分析方法(Aibar et al., 2017),结合着床前胚胎的转录组数据,将发育过程中最重要的时间和空间信息联合分析,构建了小鼠早期胚胎发育过程的系统发生树,并从分子层面重构了胚层谱系的发生过程。发育生物学的传统观点认为,内胚层主要由原肠运动过程中原条迁移出来的细胞构成。而这一研究的最新发现是,内胚层细胞可能很早就发生细胞命运特化,三胚层谱系建成时的内胚层与原始内胚层之间存在更紧密的联系。同时发现,部分外胚层和中胚层具有共同的前体细胞。这将指导发育生物学研究人员进一步通过谱系追踪等遗传学方法,研究胚层谱系建立和细胞命运决定,促进干细胞生物学研究人员对神经外胚层多能干细胞的研究,完善体外肝细胞、胰岛B细胞和脊髓神经细胞等器官前体细胞的分化体系,推动细胞治疗和药物筛选工作的发展。

                                                                                           

   图2. E2.5时期到E7.5时期的空间结构域相似性

  不同時期的顔色條代表基因表達結構域,MOR-桑椹胚,ICM-內細胞團,Epi-上胚層,PrE-原始內胚層,En-內胚層,E1-內胚層基因表達結構域1,Ect-外胚層,PS-原條,M-中胚層,MA-前端中胚層,MP-後端中胚層。計算結構域之間的相關性,連接線的粗細表示相對相關性大小。

  爲了探索胚層譜系建立過程中的關鍵信號分子,研究者進行了信號通路富集分析。結合功能實驗,首次發現Hippo/Yap信號通路在內胚層譜系發生過程中具有重要作用。同時也找到了許多在胚層譜系發生過程中關鍵的轉錄因子。這項工作系統全面地繪制了早期胚胎發育過程中,譜系建立的關鍵信號調控網絡,這將大大推動發育生物學和幹細胞生物學對細胞命運抉擇的認識,加深對生命運行機制的理解。

                                                                                            

   图3. 胚层关键信号作用区域及关键转录因子调控网络

  繪制了小鼠胚胎E5.5-E7.5時期外、中、內三胚層的關鍵信號通路作用區域;不同顔色代表不同組的轉錄因子;棕色連接線代表正相關,綠色連接線代表負相關,連接線的粗細代表相關程度;MGI數據庫中敲除小鼠表型與原腸運動異常的標注爲三角符號。

  本研究主要由中國科學院分子细胞科学卓越创新中心/生物化学与细胞生物学研究所景乃禾课题组、中國科學院-马普学会计算生物学伙伴研究所韩敬东课题组与中國科學院广州生物医药与健康研究院彭广敦课题组共同合作完成,中國科學院广州生物医药与健康研究院彭广敦研究員、中科院马普计算生物研究所索生宝博士、生物化学与细胞生物学研究所的崔桂忠博士和禹方博士为该論文的共同第一作者,景乃禾研究員、韩敬东研究員和彭广敦研究員为该論文的共同通讯作者。该工作得到了中國科學院动物研究所周琪研究員、悉尼大学Patrick P.L. Tam教授、生化与细胞所化学生物学技术平台、高性能计算存储与网络服务平台和动物实验技术平台的大力支持。这项工作得到了中國科學院战略性先导科技专项、国家重点研发计划、国家自然科学基金委员会、广东省科学技术基金、广州再生医学与健康广东省实验室前沿探索项目、上海市自然科学基金和上海市科学技术委员会的资助。

  Reference:

  1. Aibar, S., Gonzalez-Blas, C.B., Moerman, T., Huynh-Thu, V.A., Imrichova, H., Hulselmans, G., Rambow, F., Marine, J.C., Geurts, P., Aerts, J., et al. (2017). SCENIC: single-cell regulatory network inference and clustering. Nature methods.

  2. Cao, J., Spielmann, M., Qiu, X., Huang, X., Ibrahim, D.M., Hill, A.J., Zhang, F., Mundlos, S., Christiansen, L., Steemers, F.J., et al. (2019). The single-cell transcriptional landscape of mammalian organogenesis. Nature.

  3. Chan, M.M., Smith, Z.D., Grosswendt, S., Kretzmer, H., Norman, T.M., Adamson, B., Jost, M., Quinn, J.J., Yang, D., Jones, M.G., et al. (2019). Molecular recording of mammalian embryogenesis. Nature.

  4. Chen, J., Suo, S., Tam, P.P., Han, J.J., Peng, G., and Jing, N. (2017). Spatial transcriptomic analysis of cryosectioned tissue samples with Geo-seq. Nature protocols 12, 566-580.

  5. Nowotschin, S., Setty, M., Kuo, Y.Y., Liu, V., Garg, V., Sharma, R., Simon, C.S., Saiz, N., Gardner, R., Boutet, S.C., et al. (2019). The emergent landscape of the mouse gut endoderm at single-cell resolution. Nature.

  6. Peng, G., Suo, S., Chen, J., Chen, W., Liu, C., Yu, F., Wang, R., Chen, S., Sun, N., Cui, G., et al. (2016). Spatial Transcriptome for the Molecular Annotation of Lineage Fates and Cell Identity in Mid-gastrula Mouse Embryo. Developmental cell 36, 681-697.

  7. Pijuan-Sala, B., Griffiths, J.A., Guibentif, C., Hiscock, T.W., Jawaid, W., Calero-Nieto, F.J., Mulas, C., Ibarra-Soria, X., Tyser, R.C.V., Ho, D.L.L., et al. (2019). A single-cell molecular map of mouse gastrulation and early organogenesis. Nature.

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